双功能乙醛乙醇脱氢酶AdhE参与细菌与宿主互作的机制研究进展

  。随着近几年病原与机体互作机制的研究成为热点，以及新一代高通量测序、基因芯片、串联质谱标签和生物信息学等技术的发展，细菌感染宿主细胞后基因和蛋白质差异表达谱数据越发全面，研究根据结果得出醛/醇脱氢酶AdhE在细菌感染宿主的过程中也发挥着及其重要的作用。Yu等利用链球菌-仔猪感染模型，筛选细菌-宿主相互作用中调控细菌毒力所涉及的新蛋白质，鉴定出188个差异丰度蛋白，用新鉴定的差异丰度蛋白和已知的体内感染相关毒力因子构建蛋白质-蛋白质互作网络，发现体内丰度增加的AdhE是连接之前研究中假定的毒力因子和新鉴定的差异丰度蛋白的重要枢纽之一。细菌在感染宿主过程中随着机体环境的改变，其代谢基因也会出现差异表达，目前已经有研究发现大肠杆菌基因后，细菌毒力减弱，表明AdhE在细菌适应宿主内环境变化和发挥毒力时具备极其重大的调控作用。本文对AdhE参与细菌与宿主之间的相互作用进行综述，总结其参与细菌感染宿主和介导宿主天然免疫的作用机制，以期为抗细菌感染的新型疫苗和靶标药物研发提供新的思路。

  基因编码的双功能脱氢酶[12]，广泛地分布在真核生物和原核生物中，线]。这种广泛存在说明它对生命的过程有重要意义，成为近年来国际上研究的热点。研究之后发现AdhE蛋白的分布呈现出一定的规律性，多数集中在细菌中，其中有44个AdhE蛋白出现在Firmicutes门，42个AdhE蛋白出现在Proteobacteria门。Firmicutes门的这些细菌都是(G+C)mol%含量低的革兰氏阳性菌，Proteobacteria门中的这些菌大多数都是γ-Proteobacteria[13]。AdhE主要在细菌厌氧生长期间大量合成，可聚合成细螺旋丝，称为螺旋体结构[14

  ，长约0.22 μm，含有40-60个AdhE分子，在大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎耶尔森菌及肺炎链球菌[15]中均能检测到这种结构。AdhE是一种含铁酶，由N-末端乙酰化醛脱氢酶结构域(Aldehyde dehydrogenase，ALDH)和C-末端醇脱氢酶结构域(Alcohol dehydrogenase，ADH) 2个保守的结构域组成，其分子量都较大，接近100 kD，从结构可知至少具有2种催化活性。AdhE基因转录AdhE蛋白的催化活性都会受到NAD+/NADH水平的调节，它以NAD+为辅酶，依赖Fe2+和NADH将乙酰辅酶A催化还原为乙醛再到乙醇[12]，当NAD+浓度过高时也可以可逆地催化乙醇氧化为乙醛，同时释放NADH。研究之后发现AdhE是乙醇厌氧发酵途径中的一个关键酶，调控细菌中乙醇的生成，AdhE在过量表达情况下可以引起乙醇产量增加[16

  。AdhE也存在于有氧条件下，但酶的含量大幅度的降低，其活性也仅为在厌氧条件下观察到的1/10，关于AdhE在有氧条件下的功能研究还很少，有研究表明AdhE酶在有氧条件下生长的大肠杆菌中充当过氧化氢(H2O2)清除剂，为细菌提供抗氧化应激保护[17]。2 AdhE参与调控细菌感染宿主的致病机制2.1 AdhE参与调控细菌对宿主细胞的黏附与定殖

  ，LM)、猪链球菌2型(Streptococcussuis2，SS2)、肺炎链球菌感染宿主的作用机制研究中，均发现AdhE能够参与调控细菌对宿主细胞的黏附与定殖。Beckham等[6

  敲除了EHEC的AdhE基因后，发现相较于亲本株，缺失株对宿主细胞的黏附和定殖能力减弱，毒力也明显降低。此结果主要由三方面问题导致：(1)AdhE缺失导致由磷酸转乙酰酶(Pta)和乙酸激酶(AckA)催化乙酰辅酶A生成乙酸的途径，即Pta-AckA途径的代谢通量增加，生成大量乙酸盐，而高浓度乙酸盐不利于细菌的定殖[18]。(2)乙酸盐的积累会诱导调控细菌鞭毛丝的亚单位结构蛋白过表达，从而形成更多无游动功能的鞭毛散在分布于菌体四周，猜测是由于一种或多种参与组装鞭毛的蛋白被乙酰化[19-20]，导致鞭毛装配错误，丧失游动功能而无法黏附细胞。(3)与调控鞭毛基因的转录水平不同，缺失AdhE基因后会上调RNA分子伴侣hfq蛋白，hfq可选择性地清除细菌LEE毒力岛编码调控的三型分泌系统(Type Ⅲ secretion system，T3SS)转录物[21]，在转录后水平抑制T3SS调控蛋白的翻译，从而抑制细菌T3SS的功能，减少细菌对宿主的黏附。Jaradat等[22]构建突变菌株抑制LM的黏附蛋白(Listeria adhesion protein，LAP)的表达后，发现突变菌株对人结肠细胞样(Caco-2)细胞系的黏附性降低。后通过遗传同一性鉴定，证明LAP就是双功能乙醛乙醇脱氢酶AdhE (为便于阅读，下文统一将LAP改写为AdhE)，同样由N-末端乙醛脱氢酶(ALDH)和C-末端醇脱氢酶(ADH)组成[23-24]，并且可通过其N末端Gly224-Gly411结构域与哺乳动物受体热休克蛋白60 (Hsp60)相互作用促进细菌与肠上皮细胞的黏附[25-27]。Jagadeesan等[24]研究之后发现AdhE在非致病性李斯特菌物种上分泌和表达都不及致病性李斯特菌物种，推测病原体通过表达高水平的AdhE以维持细菌在宿主中的定殖。Yu等[5]证实SS2的AdhE可当作Caco-2细胞的黏附素，与哺乳动物Hsp60相互作用参与对人结肠腺癌细胞系(Caco-2细胞)的黏附，增强细菌毒力。Luong等[9]发现缺失链球菌2型D39菌株中的AdhE基因后，细菌更少地定殖于肺、鼻咽、鼻液和血液中。在受到乙醇胁迫的肺炎链球菌中，AdhE上调将乙醇氧化为乙醛并生成NADH，后者可诱导体内H2O2的生成，而对H2O2耐受的肺炎链球菌可竞争性抑制宿主中对H2O2敏感的微生物，为细菌在上呼吸道定殖提供优势[28]。2.2 AdhE参与对宿主细胞的毒性作用AdhE不仅参与了调控细菌对宿主细胞的黏附与定殖，还通过诱导肺炎链球菌和口腔链球菌(

  .oralis)中能引起细胞毒性的物质产生，从而间接参与对宿主细胞的毒性作用。Luong等[9

  研究发现通过乙醇诱导肺炎链球菌上调AdhE，会导致细菌溶血活性增强，宿主细胞损伤加重。此结果主要由两方面问题导致：(1)在乙醇存在的情况下，AdhE诱导乙醇生成乙醛和NADH，高NADH状态会触发H2O2的产生[29]，而乙醛和H2O2的积累都能在肺炎球菌感染期间引起宿主细胞中的毒性反应。H2O2是活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的常见形式，能够最终靠脂质氧化破坏细胞膜，从而抑制细胞的增殖，致癌物质乙醛可抑制DNA修复酶，干扰宿主DNA的合成与修复。(2)上调的AdhE还会诱导肺炎球菌溶血素(Ply)水平升高，Ply可通过其对呼吸道上皮和内皮细胞的毒性，破坏肺组织屏障，促进肺炎链球菌生长和扩散[30]。综合表明，乙醇胁迫肺炎链球菌可通过上调细菌的AdhE和Ply增强肺炎球菌的毒力。同时，Ply和H2O2还可以协同损害人纤毛上皮细胞[31]，从而促进肺炎球菌的感染。Pavlova等[32]对52株人口腔中存在的口腔链球菌(S.oralis)的AdhE基因做多元化的分析，首次发现部分S.oralis的AdhE只具有ADH活性但没有ALDH的活性，导致乙醇过量产生乙醛。因此，当口腔中含有乙醇时，只具有ADH活性的AdhE只能将乙醇转化为乙醛，过量的乙醛会对宿主细胞产生毒副作用，从而加重口腔疾病。3 AdhE参与细菌对宿主免疫功能的调节从目前的研究来看，AdhE不仅仅可以在细菌感染宿主时发挥功能，还参与了细菌对宿主免疫功能的调节(

  33]研究表明，AdhE参与调控细菌逃避宿主的防御机制。李斯特氏菌LM的黏附蛋白(AdhE)可与热休克蛋白60 (Hsp60)结合激活经典的NF-κB信号转导，通过上皮连接蛋白Claudin-1 occludin和E-cadherin的重新分布促进肌球蛋白轻链激酶(Myosin light chain kinase，MLCK)开放肠上皮屏障。此外，AdhE介导上皮细胞肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-6 (Interleukin 6，IL-6)的表达，在感染的早期阶段(24-48 h)促进上皮屏障功能障碍和细菌移位，减少炎症反应程度，从而躲避宿主的天然免疫。Abernathy等[8]构建鼠伤寒沙门氏菌AdhE缺失株并将其用于侵染人结肠腺癌细胞(HCT-8)，发现相较于野生型菌株，缺失株感染HCT-8细胞的菌体数量增加，且缺失株中多种编码调控T3SS的毒力岛SPI-1基因表达上调，证明AdhE缺失株可在细菌感染早期诱导SPI-1基因表达，促进细菌对上皮细胞的内化作用，有助于其逃避宿主免疫细胞识别。另外，缺乏AdhE可能还会刺激细菌I型菌毛的黏附[34-35]，促进细菌的内化作用[36]，相关机制有待进一步研究。

  的研究不仅揭示了AdhE对大肠杆菌表达运动和黏附的毒力基因有着至关重要的作用，他们还发现缺失AdhE基因后，大量表达的无功能鞭毛蛋白会增加细胞因子Toll样受体5 (Toll-likereceptor-5，TLR-5)的活化，激发宿主的保护性应答。Luong等[9]用肺炎链球菌感染肺泡巨噬细胞RAW264.7，发现感染链球菌野生型菌株中转录因子-3 (Activating transcription factor-3，ATF-3)、核转录因子(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)、中性粒细胞趋化因子CXCL和TNF-α表达水平高于缺失AdhE的突变株；而且研究证明，这种调控主要是通过AdhE上调Ply的表达，促使上皮细胞肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-6 (IL-6)和γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)的水平均升高，诱导宿主炎症反应，激活天然免疫。Drolia等[33]提出在肠道细胞膜表面表达的热休克蛋白60 (Hsp60)具有免疫传感器功能，单核细胞增生李斯特氏菌的AdhE与Hsp60相互作用后会诱导NF-κB的活化，同时诱导TNF-α和IL-6的产生，从而激活宿主的天然免疫。4 小结与展望从已有研究中可发现，AdhE与部分革兰氏阴性菌T3SS的表达调控相关联，还可以通过调控T3SS相关基因的表达进一步影响细菌毒力，因此，研究AdhE与革兰氏阴性菌T3SS之间的联系以及相互作用机制，或许可以为研发靶向药物控制细菌的毒力提供新思路。目前只有在肠出血性大肠杆菌中相关调控机制研究得较为清晰

  ，AdhE能够最终靠间接抑制T3SS相关转录物的翻译而减少细菌的定殖[6]，进一步影响细菌的毒力；在鼠伤寒沙门氏菌中，缺失了AdhE后会改变编码调控细菌T3SS系统的SPI-1毒力岛基因组的表达，从而介导细菌对宿主细胞的感染性[8]，然而具体的调控机制还有待进一步的研究；Nuss等[10]采用互作转录组分析技术(Dual RNA-seq)对肠耶尔森氏菌感染小鼠的肠相关淋巴组织派伊尔小结(Peyreʼs patch，PP)进行转录组测序研究，发现参与细菌发酵的基因AdhE表达量非常明显升高，而在细菌中发挥碳储调节剂功能的Csr基因表达量明显降低，研究人员通过Csr相关基因缺失的研究发现CsrABC水平对于细菌调控T3SS在宿主组织定殖期间的生物适应性起着至关重要的作用。在肠耶尔森氏菌中，AdhE的表达受到Csr的调控[37]，然而缺失了同样显著差异表达的AdhE后，并未发现对细菌毒力的改变，分析认为是因为肠耶尔森氏菌可以平行使用不相同的发酵途径且具有与AdhE相同功能的替代酶，所以单独的AdhE失活不足以影响细菌对宿主的感染[9]。若同时缺失肠耶尔森氏菌AdhE及其同功能的替代酶基因后，或许对细菌毒力影响会有不一样的结果。鉴于此，为了方便研究AdhE在革兰氏阴性细菌T3SS调节中的作用，Zetterström等[38]开发了一种高通量筛选方法，从10 981种化合物中筛选出3种可作为AdhE活性的乙醛非竞争性抑制剂，并且证明这3种抑制剂均对真核细胞具体低毒性或无毒性。此实验也同时为AdhE抑制剂用作研究细菌毒力和开发新型抗菌剂奠定了良好基础。另外，总结发现AdhE可能是一个潜在的优势抗原，能够有效刺激机体产生免疫应答。徐志超等[39

  利用免疫沉淀技术和生物信息学分析，筛选出AdhE和热休克蛋白60 (Hsp60)是鸡白痢沙门氏菌的优势抗原，可能在诱导宿主方面天然免疫具备极其重大作用。而在单核细胞增生李斯特氏菌[24-27]、猪链球菌2型[5]中的研究表明AdhE可以与Hsp60结合发挥调控作用，诱导宿主的天然免疫。确认和研究这个细菌上的“优势抗原”可以为细菌病血清学的诊断方法和研发细菌病的新型疫苗提供重要的科学参考。近年来，随着各类生物信息学技术的快速的提升，关于病原与机体互作机制的研究慢慢的变成了热点，且慢慢的变多的研究发现细菌的代谢酶AdhE在细菌与宿主的互作过程中会呈现出差异表达的现象。部分AdhE参与细菌与宿主互作的调控机制已经被揭示，然而还有部分仍有待进一步深入研究。Bäumler等[40

  利用转座子插入鼠伤寒沙门氏菌的AdhE导致该细菌在小鼠巨噬细胞的存活能力变弱，Li等[11]采用互作转录组分析技术(Dual RNA-seq)对胸膜肺炎放线型感染小鼠肺组织进行转录组测序研究，发现与细菌无氧代谢相关的AdhE基因差异表达最显著。不可否认这些细菌的AdhE在其感染和适应宿主内环境的过程中发挥了一定作用，深入研究AdhE对病原在机体内生理活动的影响，或许对更加全面地反映其致病原貌，揭示机体对于具体病原的抗病机制，以及筛选针对细菌病防控和治疗的候选靶标均有着深远意义。